A pregabalina non é un agonista do receptor GABAA ou GABAB.
A pregabalina é un gabapentinoide e actúa inhibindo certas canles de calcio. En concreto, é un ligando do sitio da subunidade α2δ auxiliar de certas canles de calcio dependentes da tensión (VDCCs) e, polo tanto, actúa como un inhibidor dos VDCC que conteñen a subunidade α2δ. Hai dúas subunidades α2δ de unión a fármacos, α2δ-1 e α2δ-2, e a pregabalina mostra unha afinidade similar por estes dous sitios (e, polo tanto, falta de selectividade entre eles). A pregabalina é selectiva na súa unión á subunidade α2δ VDCC. A pesar do feito de que a pregabalina é un análogo do GABA, non se une aos receptores GABA, non se converte en GABA nin noutro agonista do receptor GABA in vivo e non modula directamente o transporte nin o metabolismo do GABA. Non obstante, descubriuse que a pregabalina produce un aumento dependente da dose na expresión cerebral da descarboxilase do ácido L-glutámico (GAD), o encima responsable de sintetizar GABA e, polo tanto, pode ter algúns efectos indirectos de GABAérxico ao aumentar os niveis de GABA no cerebro. Actualmente non hai evidencia de que os efectos da pregabalina estean mediados por ningún mecanismo que non sexa a inhibición dos VDCC que conteñen α2δ. De acordo, a inhibición dos VDCC que conteñen α2δ-1 pola pregabalina parece ser responsable dos seus efectos anticonvulsivos, analxésicos e ansiolíticos.
Os α-aminoácidos endóxenos L-leucina e L-isoleucina, que se parecen moito á pregabalina e aos outros gabapentinoides na súa estrutura química, son ligandos aparentes da subunidade α2δ VDCC cunha afinidade similar á dos gabapentinoides (por exemplo, IC50 = 71 nM para L- isoleucina) e están presentes no líquido cefalorraquídeo humano a concentracións micromolares (por exemplo, 12,9 μM para L-leucina, 4,8 μM para L-isoleucina). Teorizouse que poden ser os ligandos endóxenos da subunidade e que poden antagonizar competitivamente os efectos dos gabapentinoides. De acordo, aínda que os gabapentinoides como a pregabalina e a gabapentina teñen afinidades nanomolares pola subunidade α2δ, as súas potencias in vivo están no rango de micromolares baixos, e dise que a competencia pola unión dos L-aminoácidos endóxenos probablemente é a responsable desta discrepancia.

Nun estudo descubriuse que a pregabalina posúe unha afinidade 6 veces maior que a gabapentina polos VDCC que conteñen subunidades α2δ. Non obstante, outro estudo descubriu que a pregabalina e a gabapentina tiñan afinidades similares pola subunidade α2δ-1 recombinante humana (Ki = 32 nM e 40 nM, respectivamente). En calquera caso, a pregabalina é de 2 a 4 veces máis potente que a gabapentina como analxésico e, en animais, parece ser de 3 a 10 veces máis potente que a gabapentina como anticonvulsivo.